Green Sap – Ricerca scientifica

RICERCA SCIENTIFICA

Durante il processo di sviluppo del prodotto, le diverse fasi della ricerca sul campo sono state ordinate in concomitanza con i test di laboratorio.

In questa occasione, vengono scelti per la presentazione i dati ottenuti in prove di ricerca di laboratorio in relazione alle proprietà antitumorali di GREEN SAP perché questa è la sua principale azione terapeutica.

Gli studi scientifici sono stati condotti in Argentina nell’ambito di diversi STAN (High Level Technical Services) presso CONICET (Consiglio nazionale per la ricerca scientifica e tecnica) http://www.conicet.gov.ar, attraverso la sua unità esecutiva CEFYBO (Center per studi farmacologici e botanici) http://www.conicet.gov.ar/php/datosue.php?n=02669. Nello stesso Green Sap ha dimostrato di possedere un effetto citotossico, citostatico “in vitro”.

Successivi studi “in vivo” presso lo stesso istituto dimostrerebbero, tra l’altro, che negli individui indotti da tumore, la mortalità di tutti i controlli avverrebbe 40 giorni dopo l’inoculazione di un tumore (linfoma ascite), mentre nei gruppi trattati per via orale con Green Sap 260 giorni dopo l’inoculazione, gli esemplari sono rimasti vivi.

Approfondiremo questi studi protocollati in questa appendice.

STUDIO IN VIVO

RELAZIONE SULLA VALUTAZIONE DELL’ESTRATTO DENOMINATO SAP VERDE E DEI SUOI ​​SINGOLI COMPONENTI SULLA PROLIFERAZIONE DELLE CELLE BW5147 I. DESCRIZIONE:

L’azione antiproliferativa del prodotto Green Sap è stata valutata su cellule di linfoma murino BW5147 in vitro utilizzando curve dose-risposta e a diversi tempi di esposizione a detti prodotti, in loro colture in presenza ed assenza di detto estratto vegetale, dei suoi singoli componenti oppure La risposta proliferativa è stata determinata mediante la tecnica di incorporazione della [3H] -timidina ([3H] -TdR) al DNA cellulare e successiva valutazione della radioattività nucleare mediante spettrometria a scintillazione liquida.

II. SPECIFICA METODOLOGICA:

1 – Estratti vegetali: Gli estratti vegetali valutati corrispondono alla seguente descrizione:

.::. Tintura Madre (TM): Corrisponde ad una tintura costituita dalla miscela di tre tinture singole, ovvero: tintura Baccharis articulata 40% v/v; Tintura di Rosmarinus officinalis 40% v/v e tintura Plantago major 20% v/v. Il contenuto alcolico della tintura madre è del 50%.

.::. Prodotto finale 1 (PF1) u Green Sap: Corrisponde ad una diluizione 1/10 della tintura madre in acqua (tintura Baccharis articulata 4% v/v; tintura Rosmarinus officinalis 4% v/v, tintura Plantago major 2% v/v v e gradazione alcolica del 5% v/v).

.::. Prodotto finale 3 (PF3): Corrisponde ad una diluizione 1/10 della tintura madre, con aggiunta di alcool ad una concentrazione finale del 15% v/v.

2 – Linea di linfoma murino: La linea utilizzata corrisponde ad un linfoma T murino, denominato BW5147, originato da un tumore spontaneo di topi AKR/J adattati alla coltura, originario dei Jackson Laboratories, USA, sensibile al cortisolo (10 -6 M) ed esprime l’aplotipo H-2k e i seguenti marcatori: CD3+, recettore T ab e Thy 1.1, che vengono routinariamente controllati mediante citometria a flusso con anticorpi monoclonali specifici.

3 – Condizioni di coltura e valutazione della proliferazione cellulare: Le cellule BW5147 (3-5 X 105 cellule/ml) sono state coltivate in terreno RPMI 1640 integrato con siero fetale bovino 10% e glutammina 2 mM in presenza dell’antibiotico penicillina (100U/ ml) e streptomicina (100µg/ml), in piastre da 96 pozzetti (volume finale 0,2 ml), in condizioni di sterilità (flusso laminare, Steril Guard Hood classe II, Tipo a/B3; marca: Baker Company, modello: SG-400m ), e in un ambiente gasato al 5% di CO2 (forno a gas CO2; marca: Forma Scientific; modello: 3111). Le colture sono state effettuate con concentrazioni crescenti dei suddetti estratti vegetali durante 24, 48 e 72 ore di incubazione. Le cellule sono state pulsate con 0,75 µCi/pozzetto di [3H] TdR (S = 25 Ci/mmol) 16 h prima del sacrificio delle colture (per congelamento a -20°C). Le colture sono state successivamente scongelate e filtrate attraverso filtri in fibra di vetro, Whatmann GF/A. Il [3H] -TdR incorporato nel DNA nucleare e trattenuto su detti filtri è stato quantificato mediante spettrometria di scintillazione liquida utilizzando cocktail di scintillazione commerciali. I risultati (ottenuti in dpm) sono stati espressi come Percentuale di Inibizione (% Inhib) considerando come 100% il dpm ottenuto in assenza di estratto e/o in presenza del veicolo.

4 – Determinazione della vitalità cellulare: La vitalità cellulare in tempi diversi in presenza o assenza di TM e PF è stata valutata mediante conta cellulare microscopica in una camera Neubauer, utilizzando un colorante di esclusione, Trypan Blue. Le corrispondenti % di Vitalità sono state calcolate tenendo conto del numero di cellule viventi (che non includono il colorante di esclusione) rispetto alle cellule totali (Live + Dead, cioè quelle cellule che incorporano il colorante e appaiono blu all’osservazione microscopica) .

5- Analisi statistica dei risultati: I risultati sono stati analizzati utilizzando il test di Student e l’analisi della varianza seguiti dal test di Dunnet per determinare le differenze significative tra i gruppi. I valori sono stati considerati statisticamente significativi quando p £ 0,05.

III. RISULTATI

.::. Azione antiproliferativa dose-risposta di estratti vegetali su cellule BW5147 a 24 ore di coltura:

TABELLA 1: Percentuale di inibizione della proliferazione delle cellule del linfoma T indotta dall’aumento delle concentrazioni di Green Sap, sua tintura madre e PF3, a 24 h di coltura.

DILUCIÓN a

TM

DILUCIÓN a

PF1

PF3

% Inhibb

% Inhibb

% Inhibb

1/25

93.3 ± 2.9*

1/2.5

N.D.

N.D.

1/100

79.5 ± 5.9*

1/10

84.7 ± 3.6*

85.3 ± 3.9*

1/250

60.3 ± 2.5*

1/25

71.4 ± 3.1*

71.1 ± 7.7*

1/500

51.5 ± 3.4*

1/50

44.4 ± 5.2*

45.0 ± 4.0*

1/1000

30.8 ± 3.5*

1/100

23.7 ± 5.1*

49.0 ± 2.5*

1/2000

22.2 ± 3.7#

1/200

17.0 ± 2.5#

28.7 ± 2.4*

1/4000

10.7 ± 1.1

1/400

5.1 ± 0.9

22.7 ± 2.6#

1/8000

6.0 ± 0.7

1/800

1.1 ± 0.8

5.2 ± 0.5

a) Sono state utilizzate diluizioni correlate di TM e PF in base alla loro proporzione in TM. Il volume totale della diluizione dei prodotti vegetali aggiunti è stato di 0,02 ml, il volume massimo che può essere aggiunto senza diluire l’apporto di nutrienti nel terreno di coltura. Si precisa che per questo motivo non è stato possibile valutare la diluizione di PF1 e PF3 (1/2,5) equivalente alla diluizione 1/25 di TM (N.D. = non determinato).

b) Le percentuali di inibizione sono state calcolate considerando come 100% la radioattività di [3H] -TdR incorporata nelle colture basali (cioè in assenza di prodotto vegetale): 24024 ± 1206 dpm. Si noti che la presenza di 1,5 e il 2% del veicolo alcolico (contenuto alcolico della diluizione 1/25 di PF3 e TM rispettivamente) stimola la proliferazione cellulare di circa il 25%. Tutte le altre diluizioni degli estratti vegetali sono state effettuate mantenendo una concentrazione alcolica finale costante dello 0,5% che non ha influito sulla proliferazione basale. I risultati mostrati sono la media ± E.S. di n = 5 esperimenti eseguiti in triplicato.

.::. Differisce significativamente dalla linea di base con p £ 0,01

.::. Differisce significativamente dalla linea di base con p £ 0,05

.::. Azione dose-risposta dei singoli coloranti sulla proliferazione delle cellule BW5147 a 24 ore di coltura:

TABELLA 2: Effetto dell’aumento delle concentrazioni dei singoli coloranti sulla proliferazione cellulare BW514747

a) Ogni singolo estratto di tintura è stato diluito in terreno di coltura contenente una concentrazione alcolica finale del 50% e nelle stesse proporzioni di quelle contenute nella TM. Su ciascuna piastra è stato eseguito un controllo positivo corrispondente alla diluizione 1/25 di TM, con cui si è ottenuta in tutti i casi una % di Inhib ³ 94%.

b) Le percentuali di inibizione mostrate sono la media ± SE di n = 2 determinazioni effettuate in triplicato e sono state calcolate come spiegato sopra.

.::. Differisce significativamente dalla linea di base con p £ 0,01

.::. Differisce significativamente dalla linea di base con p £ 0,05

.::. Azione antiproliferativa dose-risposta di estratti vegetali su cellule BW5147 a 48 ore di coltura:

TABELLA 3: Percentuale di inibizione della proliferazione delle cellule del linfoma T indotta dall’aumento delle concentrazioni di Green Sap, sua tintura madre e PF3, a 48 h di coltura

a) Le diluizioni correlative di TM e PF sono state utilizzate come descritto nella Tabella 1.

b) Le percentuali di inibizione sono state calcolate prendendo come 100% la radioattività di [3H] -TdR incorporata nelle colture basali: 32360 ± 1165 dpm A 48 ore di coltura non si sono osservate differenze significative con 1,5% e 2% del veicolo contenuto alcolico (diluizione 1/25 di PF3 e TM, rispettivamente) rispetto alla proliferazione basale. Tutte le altre diluizioni degli estratti vegetali sono state effettuate mantenendo una concentrazione alcolica finale costante dello 0,5% che non ha influito nemmeno sulla proliferazione basale. I risultati mostrati sono la media ± E.S. di n = 5 esperimenti eseguiti in triplicato.

.::. Differisce significativamente dalla linea di base con p £ 0,01.

.::. Differisce significativamente dalla linea di base con p £ 0,05

.::. Azione antiproliferativa dose-risposta di estratti vegetali su cellule BW5147 a 72 ore di coltura:

TABELLA 4: Percentuale di inibizione dose-risposta indotta da Green Sap, sua tintura madre e PF3 sulla proliferazione delle cellule di linfoma T a 72 h di coltura.

DILUCIÓN a

TM

DILUCIÓN a

PF1

PF3

% Inhibb

% Inhibb

% Inhibb

1/500

54.1 ± 6.8*

1/50

61.2 ± 6.8*

64.5 ± 5.1*

1/1000

49.0 ± 4.0*

1/100

40.1 ± 2.8*

46.0 ± 4.6*

1/2000

39.3 ± 3.1*

1/200

20.6 ± 1.1#

26.1 ± 3.0*

1/4000

29.0 ± 4.8#

1/400

19.4 ± 1.7

28.8 ± 1.7*

a) Le diluizioni correlative di TM e PF sono state utilizzate come descritto sopra.

b) Le percentuali di inibizione sono state calcolate prendendo come 100% la radioattività di [3H] -TdR incorporata nelle colture basali: (16781 ± 1188) dpm. In tutte le diluizioni è stata mantenuta una gradazione alcolica dello 0,5%, che non ha modificato la proliferazione basale. I risultati mostrati sono la media ± E.S. di n = 5 esperimenti eseguiti in triplicato.

.::. Differisce significativamente dalla linea di base con p £ 0,01.

.::. Differisce significativamente dalla linea di base con p £ 0,05

.::. Azione degli estratti vegetali sulla vitalità delle cellule BW5147 in diversi tempi di coltura:

TABELLA 5: Effetto di TM e PF3 sulla vitalità cellulare in colture in diversi tempi di studio

TIEMPO

(horas)

% VIABILIDAD a

TM

PF3

1/500

1/2000

1/4000

1/50

1/200

1/400

24

61.3 ± 10.9#

84.7 ± 5.1

71.7 ± 2.0

72.5 ± 11.4

72.0 ± 6.6

85.6 ± 4.5

48

50.3 ± 11.3*

80.3 ± 4.1

76.7 ± 0.6

49.0 ± 9.8*

77.0 ± 3.3

76.7 ± 2.9

72

34.3 ± 1.0*

76.7 ± 1.9*

84.3 ± 2.8#

24.3 ± 1.2*

60.4 ± 2.3*

80.6 ± 2.8*

a) La % di vitalità in ogni istante (media ± SE di n = 3 esperimenti) è stata calcolata tenendo conto del numero di cellule vive (che non includono il colorante di esclusione Trypan Blue) rispetto alle cellule totali (live + morte: cellule che incorporano il colorante e appaiono blu all’osservazione microscopica). I risultati sono stati confrontati con i valori medi corrispondenti ai valori basali e le cellule incubate per gli stessi tempi in terreno con 0,5% di alcol, di seguito dettagliati: (95,3 ± 1,2)%, (94,0 ± 1,4)% e ( 94,3 ± 1,0)% a 24, 48 e 72 ore, rispettivamente.

.::. Differiscono significativamente dai valori di base con p £ 0,01

.::. Differiscono significativamente dai valori di base con p £ 0,05

CONCLUSIONI:

– Si osserva un effetto inibitorio (Fig. 1-3, Tabelle 1, 3 e 4) della proliferazione delle cellule di linfoma T murino BW5147 indotta dai prodotti vegetali TM, PF1 e PF3. Questo effetto dipende dalla concentrazione. Si osserva nei tre tempi studiati, 24, 48 e 72 ore di coltura. È massimo a 48 ore di coltura per le dosi più elevate e si osserva un potenziamento a 72 ore di coltura degli effetti indotti dalle diluizioni più elevate. In questo momento, però, è necessario considerare il possibile contributo dei meccanismi di inibizione del contatto tra cellule in coltura, che raddoppiano ogni 12-14 ore (Cremaschi et al, J. Neuroimmunol, 2000, 110: 57).

– È stata trovata una concordanza tra gli effetti esercitati da FP e TM, nei tre tempi studiati.

– La valutazione degli effetti degli estratti della singola tintura diluiti e testati nelle stesse proporzioni di quelli contenuti nella TM, permette di verificare un effetto sinergico dei tre componenti (Tabella 2, Fig. 4).

– L’osservazione microscopica con un colorante di esclusione permette di dedurre che sia PF che TM hanno un effetto citostatico a 24 ore poiché non hanno modificato significativamente la vitalità cellulare, tuttavia con il tempo sembrerebbe esserci anche un effetto citotossico in cui non si può escludere la partecipazione di altri fattori inerenti alla coltura cellulare (Tabella 5, Fig. 5 e 6).

Conclusione finale: sia i TM che i loro PF esercitano un forte effetto antiproliferativo sul linfoma T BW5147, il che giustifica il proseguimento della valutazione della loro azione sul comportamento biologico del linfoma in vivo.

Rapporto preliminare Studio in vivo

L’efficacia antitumorale del prodotto GREEN SAP (PF3) è stata determinata in uno studio preliminare. Per questo sono stati utilizzati 50 topi femmina del ceppo BALB/c. Tutti i topi sono stati inoculati con cellule tumorali corrispondenti a una linea cellulare di linfoma T chiamata LBC, che sono state somministrate per via intraperitoneale (106 cellule/ml). I topi sono stati poi divisi in 5 gruppi di 10 animali ciascuno per seguire differenti trattamenti. I gruppi sono stati: 1) trattati con PF3 diluito 1/400 (equivalente alla dose terapeutica nell’uomo), 2) controllo (senza ricevere trattamento con il prodotto) 3) trattati con PF3 1/200, 4) trattati con PF3 1/ 50 e 5) trattati con alcool in concentrazione equivalente a quella presente nella dose più alta di PF3. Il trattamento con PF3 è iniziato 8 giorni dopo l’inoculazione delle cellule, momento in cui l’ascite ha cominciato a diventare palpabile. Il prodotto PF3 è stato somministrato per via orale giornalmente una volta al giorno. Durante lo studio, gli animali sono stati pesati a giorni alterni, al fine di registrare le variazioni di peso corporeo (indicatore dell’aumento del volume ascitico). I parametri studiati sono stati: aumento del peso corporeo ({[peso medio prima del trattamento – peso medio dopo il trattamento]/peso medio prima del trattamento} x100 (Figura 1, aumento del peso corporeo in funzione del tempo post-inoculazione), mortalità (Figura 2,% di mortalità in funzione del tempo post-inoculazione) e il tempo di sopravvivenza è stato calcolato tenendo conto del tempo vissuto da ciascun topo dal momento dell’inoculazione con cellule tumorali, per ogni trattamento, ed è espresso come media insieme al siero standard (Tabella 1). Gli animali morenti venivano posti in formalina per effettuare i corrispondenti studi di anatomia patologica, per valutare la comparsa o la scomparsa delle metastasi.

Conclusioni:

Aumento del peso corporeo

Animali di controllo: l’aumento di peso è esponenzialmente correlato al tempo post-inoculazione. Con il passare del tempo, il peso aumenta notevolmente fino alla mortalità del 100% degli animali.

Animali trattati: In questo caso si ha un aumento e una diminuzione del peso corporeo per tutta la durata del trattamento, prolungando il tempo di sopravvivenza. Ciò sembrerebbe compatibile con l’effetto citostatico osservato “in vitro”. Vale la pena notare che maggiore è la dose di PF3, minore è l’aumento di peso osservato, come avviene con PF3 1/50 e PF3 1/200. Gli animali rimasti in vita fino ad oggi mostrano un aumento di peso dello 0%.

Mortalità

In tutti i casi, corrispondenti a trattati e controlli, si ha mortalità in funzione del tempo post-inoculazione.

Controlli: Le percentuali di mortalità sono più alte in tempi brevi rispetto a quelli trattati. Raggiungere una mortalità del 100%.

Trattati: Con la dose terapeutica, la stessa percentuale di mortalità osservata con le altre dosi e anche con i controlli si verifica in tempi più lunghi, indicando una maggiore percentuale di sopravvivenza degli animali. La mortalità negli animali trattati non ha raggiunto il 100%. Ad oggi vengono mantenuti in vita 1 animale corrispondente alla dose terapeutica, 2 alla dose 1/200 e 1 alla dose 1/50.

Tabella 1. Tempo di sopravvivenza degli animali di controllo e di quelli trattati con PF3.

Tratamiento

Dosis terapéutica (1/400)

Dosis 1/200

Dosis 1/50

Control

Alcohol

Tiempo de sobrevida ( X ± ESM)

39,2 ±13,3

47,5 ± 17,9

34,3 ± 13,4

19 ± 0,61

23 ± 3,75

Nota: i valori del tempo di sopravvivenza corrispondenti alla dose terapeutica, 1/200 e 1/50, potrebbero essere anche più alti, poiché ad oggi ci sono animali vivi: 1 della dose terapeutica, 2 della dose 1/200 e 1 animale corrispondente alla dose 1/50. Questi valori sono stati ottenuti tenendo conto della sopravvivenza fino al 10 febbraio 2005 (155 giorni dopo l’inoculazione).