Investigação cientifica:

Através do processo de desenvolvimento do produto, se foram sorteando diferentes etapas de investigação de campo,  paralelamente com provas de laboratório.

Nesta oportunidade se elegem para sua apresentação os dados obtidos em ensaios de investigação em laboratório "In vitro" e "In Vivo" em relação às propriedades antitumorales de GREEN SAP, devido a que esta é sua principal ação terapêutica

Os estudos científicos se estão  realizando no Conselho de Investigações Científicas e Técnicas (CONICET), instituição oficial Argentina dependente do Ministério de Educação Ciência e Tecnologia da Presidência da Nação, através de sua unidade Centro de Estudos Farmacológicos e Botânicos (CEFYBO).

Protocolo do Ensaio de Investigação

Protocolo do Trabalho

Ensaios cinéticos de proliferação celular.
Estes ensaios foram feitos em dois tipos de células:
1. Células tumorais: Línea Tumoral Linfóide de Origem Murino BW5147 que expressa no alótipo H-2K, CD3+ e o TCRaß, os quais são testados com freqüência por citometria de fluxo usando anticorpos específicos contra os correspondentes marcadores de superfície.
2. Linfócitos T normais, extraídos de ínguas linfáticas de ratos das cepas BALG/c de três a quatro meses de idade, obtidos em forma acéticas.

Os ensaios “In Vitro” são realizados em condições de esterilidade em microplacas de cultivo de 96 Wells em um volume final de 0,2 ml. 
O efeito da proliferação celular da mistura a ensaiar se medirá a diferentes tempos de cultivo (24, 48, 72 y 96 hs.) e em ausência (controle) o presença de diferentes concentrações da mistura com a finalidade de determinar a cinética de ação do produto. As concentrações a ensaiar serão dissoluções seriadas ao meio em um lapso de concentrações que inclui a dose proposta para usos em humanos, desde 1/250 até 1/4000. 
A proliferação celular será avaliada por meio da técnica de incorporação de Timidina Tritiada (20 Ci/mmol). Para isto os cultivos celulares serão pulsados por um período de 16 horas no casso de linfócitos normais e de 6 horas para a células tumorais com Timidina Tritiada, após o qual os núcleos celulares são retidos por filtrações de papel de fibra de vidro, whatmann GF/A. A timidina radioativa incorporada ao DNA será quantificada em contador liquido Wallac.
A concentração de células a utilizar será para a línea tumoral de 3 x 105 concentração celular ótima final e para as células normais 2 x 106 celulas/mililitros.

Ambos tipos celulares serão cultivados em meio RPMI 1640 suplementado com 10% de soro fetal bovino e 2 mM de glutamina e em presença dos antibióticos: penicilina (100U/ml) e esptreptomicina (100µ/ml).

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Efeito Sinérgico

ESTUDO DO EFEITO SINERGICO DAS ERVAS

Foi feito um trabalho cientifico para demonstrar o efeito cinergico das três ervas que compõem o produto, para isso foi determinada a porcentagem de inibição da proliferação da célula tumoral pela tintura final e de cada tintura de extrato de erva separadamente em diferentes diluções.
O seguinte quadro amostra os resultados obtidos como porcentagem de inibição do crescimento das líneas celulares BW5147 em diferentes diluções de tintura (mistura das três ervas).

TINTURA

 

 

Dilução

Células Linfoma Murino BW5147

Índice de Estimulação
(%)

Inibição
(%)

1/25
0.03
97.4
1/50
0.045
95.3
1/100
0.11
88.7
1/250
0.26
74.0
1/500
0.48
51.7
1/1000
0.70
29.6
1/2000
0.88
12.4
1/4000
0.87
13.0


QUADRO I: Porcentagem de inibição de crescimento de líneas celulares BW5147 a diferentes diluções de tintura.

TINTURAS DE EXTRACTOS INDIVIDUAIS:

No seguinte quadro se apresenta o efeito inibitório das tinturas das três ervas separadas, medidas como porcentagem de inibição do crescimento da célula tumoral.


Dilução
PLANTAGO (P)
CARQUEJA (C)
ALECRIM (R)
Índice de Estimulação
Inibição
(%)
ÍÍndice de Estimulação
Inibição
(%)
Índice de Estimulação
Inibição
(%)
1/25
0.75
24.9
0.50
49.7
0.12
88
1/50
0.73
26.8
0.58
42
0.21
78.5
1/100
0.98
1.9
0.85
14.5
0.41
58
1/500
1.0
0
1.04
0
1.12
0

QUADRO II: Efeito inibitorio das tinturas das tres ervas por separado


No casso das tinturas de extratos individuais foi comprovada uma notória porcentagem de inibição da proliferação da célula tumoral de cada erva separada com destacável porcentagem do Alecrim, o que mostrou uma alta superioridade nas diferentes diluções.
Comprando os efeitos inibitórios a iguais diluções é comprovada que em todos os casos é maior o efeito da mistura que qualquer das ervas separadas, marcando claramente o indicado efeito sinérgico na dilução 1/500, ponto em que os extratos por separado não apresentam inibição alguma, em contraposição com a mistura que nesta mesma dilução apresenta uma porcentagem de inibição do crescimento da célula tumoral de um 51,7%.


Curva – Dose Resposta

 

Cinética Celular – 24 e 48 horas

Uma vez determinada a formula e a dosagem ótima de acordo a ação inibitória do crescimento em líneas celulares BW em 24 horas, passou-se a experimentar a cinética em 48 horas.
No quadro 1: “Inibição do crescimento em líneas celulares em 24 horas”, se apresentam os resultados das formulações PF1 e PF3, como porcentagem de inibição do crescimento de líneas celulares BW em 24 horas, que na primeira fase de experimentação amostraram diferenças significativas referentes as porcentagens de inibição de crescimento celular.

Dilução
PF1
PF3
Índice de estimulação
Inibição
(%)
Índice de estimulação
Inibição
(%)
1/10
0.15
84.7
0.14
85.3
1/25
0.28
71.4
0.26
73.6
1/50
0.52
47.9
0.53
47.0
1/100
0.76
23.7
0.58
41.8
1/200
0.89
10.9
0.68
31.7
1/400
0.95
4.3
0.77
22.9
QUADRO 1: Inibição do crescimento em líneas celulares em 24 horas.

Novamente tal como se aprecia no Quadro 1: “Inibição do crescimento em líneas celulares BW em 24 horas”, a diluções maiores os sucessivas porcentagens de inibição foram decrescentes, resultando a maior efetividade da formulação PF3.
No Quadro 2: “Inibição do crescimento em líneas celulares BW em 48 horas”, se apresentam os resultados expressados como porcentagens de inibição de crescimento em líneas celulares BW em 48 horas.
Outra vez se incnluiram as formulações PF1, e PF3 porque estas apresentarão na primeira fase da experimentação diferenças significas referentes as porcentagens de inibição de crescimento celular, pretendendo-se descartar a possibilidade de um comportamento diferente nas 48 horas.

 

Dilução
PF1
PF3
Índice de estimulação
Inibição
(%)
Índice de estimulação
Inibição
(%)
1/10
0.001
99.8
0.001
99.87
1/25
0.007
99.2
0.002
99.7
1/50
0.16
84.0
0.028
97.0
1/100
0.68
31.57
0.24
75.0
1/200
0.87
13.0
0.65
31.0
1/400
0.92
7.8
0.72
28.2
QUADRO 2: Inibição do crescimento em líneas celulares BW em 48 horas

Como primeira conclusão nas duas formulações após as 48 horas o efeito de inibição na dose terapêutica foi maior que nas 24 horas o que demonstra um efeito de acumulação (cinética de acumulação) em beneficio do objetivo desejado que é o efeito anti-proliferativo.
Também nas 48 horas, a maior inibição em termos absolutos do crescimento em líneas celulares BW nas doses terapêuticas resultou da formulação PF3.
É assim que é estancada a cinética celular impedindo o crescimento celular.