Investigation Scientifique:

Travers le procès de développement du produit différent étapes d’investigation ont fut réalisés au même moment des études  de laboratoires.

Dans cette opportunité ont fut choisi pour leur présentation les dates obtenus dans les essais d’investigation en laboratoire « in vitro » et « in vivo » en relation aux  les propriétés antitumoral de GREEN SAP due á que c’est son principale action thérapeutique.

Les études scientifiques se réalisent dans le Conseil des investigations scientifiques et techniques (CONICET), institut officielle argentine dépendant du Ministère d’éducation, science et technologie de la Présidence de la Nation travers de son unité exécutive Centre des études pharmacologiques et botaniques (CEFYBO)

Dans l'étude in vivo:

Protocole d’ Investigation Scientifique

ETUDES SCIENTIFIQUES REALISÉS AVEC GREEN SAP

PROTOCOLE DU TRAVAIL

Essais cinétiques de prolifération cellulaire Ces essais seront réalisés sur deux types cellulaires:

  1. Cellules tumorales: Ligne tumoral lymphoïde d’ origine mourine BW 5147 qu’ expresse l’ haplotype H-2k, CD3+ et le TCRaß, lesquels sont testés de routine par cytometrie de flux utilisant anticorps spécifiques contre les correspondants marqueurs de surface.

  2. Lymphocytes T normales provenant de ganglions lymphatiques de ratons decèpe BALG/c de 3-4 mois d’age, obtenus en forme aseptique.

Les essais in vitro seront réalisés en conditions de stérilité en microplaques de culture de 96 wells en un volume final de 0.2 ml. L’effet sur la prolifération cellulaire de la mélange a essayer sera évaluée á temps différentes de culture (24, 48, 72 y 96 hs.) et en absence (Control) ou présence de différentes concentrations de mélange á fin de déterminer la cinétique d’action du produit. Les concentrations á essayer seront dilutions sériées au moyenne dans un range des concentrations qu’ incluent la dose proposée par usage en humaines (á partir de 1/250 jusqu’au 1/4000). La prolifération cellulaire sera évaluée a travers de la technique d’incorporation de Timidine tritié (20 Ci/mmol). Pour ça , les cultives cellulaires seront pulsés pour un période de 16 hs dans le cas des lymphocytes normales et de 6 hs pour les cellules tumorales avec Timidina tritié, a prés ça les nucleus cellulaires sont retenus par filtration de papier de fibre de verre, Whatmann GF/A. La Timidine radioactive incorporée au ADN sera quantifié avec compteur de étincelle liquide Wallac.

La concentration de cellules á utiliser sera: pour la ligne tumoral de 3x105 cellules/ml (concentration cellulaire optime final) et pour les cellules normales 2x106 cellules/ml. Tous les deux types cellulaires seront cultivés en medio RPMI 1640 supplémenté avec 10% de sérum foetal bovine y 2mM de glutamine et en présence des antibiotiques penicillium (100 U/ml) et streptomycine (100 µg/ml).

 

Courbe Dose - Réponse

PRODUIT FINAL (PF)

Une fois confirmé l’effectivité de la formulation de la teinture a travers expérimentation avec animaux, on a réalisé un balayage comprendrant un ample spectre avec différentes dilutions et véhicules. De ce balayage s’ont fut obtenus les dates de la Table 1: "Courbe Dose – Réponse"

Dilution

PF1  (90% Solvant 1. 10% TM)

PF2 (85% Solvant 1, 5% Solvant 2, 10% TM)

PF3 (80% Solvant 1, 10% Solvant 2, 10% TM)

I.E.

% Inhib

I.E.

% Inhib

I.E.

% Inhib

1/10

0.22

77.0

0.24

76.25

0.23

77

1/25

0.35

64.8

0.44

55.8

0.46

53.6

1/50

0.60

39.9

0.67

33

0.62

38.2

1/100

0.87

12.8

0.78

21.9

0.66

34.2

1/200

0.98

2.2

0.96

0

0.73

27

1/400

1.03

0

0.99

0

0.86

13.8

TABLA 1: "Courbe Dose - Réponse"

Comme s’évidence dans la Figure 1: "Graphique Courbe Dose - Réponse" la dose optime (meilleur effet thérapeutique avec nulles effets secondaires) est 1/400 et la formulation optime est la PF3 laquelle a démontrée un pourcentage lequel a démontrée un pourcentage d’ inhibition de prolifération cellulairede 13.8 % á la mentionnée dilution.

 

Cinétique Cellulaire "In Vitro"

Une fois déterminée la formulation et la posologie optime d’accord á l’action inhibitoire du développement en lignes cellulaires BW en 24 heures s’a passé á expérimenter la Cinétique en 48 heures.

Dans la TABLE 1: "Inhibition du développement en ligne cellulaire BW en 24hs." se présentent les résultats des deux formulations (PF1 y PF3), comme pourcentage de la inhibition du accroissement de lignes cellulaires BW en 24 heures, que dans la phase d’expérimentation ont montré différences significatives rapporté aux pourcentages d’inhibition du accroissement cellulaire.

 

Dilution

PF1

PF3

Index de Stimulation

Inhibition(%)

Index de Stimulation

Inhibition(%)

1/10

0.15

84.7

0.14

85.3

1/25

0.28

71.4

0.26

73.6

1/50

0.52

47.9

0.53

47.0

1/100

0.76

23.7

0.58

41.8

1/200

0.89

10.9

0.68

31.7

1/400

0.95

4.3

0.77

22.9

TABLA 1: Inhibition du accroissement en ligne cellulaire BW en 24hs.

 

De nouveau comme on voit dans la Table 1: "Inhibition du accroissement en ligne cellulaire BW en 24hs.", a meilleures dilutions les successives pourcentages d’ inhibition ont fut décroissantes, résultant la meilleur effectivité de la formulation PF3.

Dans la TABLE 2: "Inhibition d’ accroissement en ligne cellulaire BW en 48hs.", se présentent les résultats s’express comme pourcentage d’inhibition d’ accroissement en lignes cellulaires BW en 48 heures. De nouveau s’incluent les formulations PF1 et PF3 du á qu’elles dans la première phase d’ expérimentation ont montrés différences significatives rapportés aux pourcentages d’inhibition d’accroissement cellulaire, prétendrant écarter la possibilité d’un comportement différent aux 48 heures.

 

Dilution

PF1

PF3

Index de Stimulation

Inhibition (%)

Index de Stimulation

Inhibition (%)

1/10

0.001

99.8

0.001

99.87

1/25

0.007

99.2

0.002

99.7

1/50

0.16

84.0

0.028

97.0

1/100

0.68

31.57

0.24

75.0

1/200

0.87

13.0

0.65

31.0

1/400

0.92

7.8

0.72

28.2

TABLA 2: Inhibition d’accroissement en ligne cellulaire BW en 48hs.

Comme première conclusion en tous les deux formulations après les 48 heures l’effet d’inhibition á la dose thérapeutique fut meilleure qu’aux 24 heures, ça démontre un effet d’accumulation (cinétique d’accumulation) en bénéfice de l’objective désirée qui est l’effet antiproliférative. Aussi aux 48 heures, la meilleure inhibition en termes absolues d’accroissement en lignes cellulaires BW á la dose thérapeutique résulta de la formulation PF3.

De cette manière s’arrête la cinétique cellulaire évitant l’accroissement tumoral.

 

Effet Cytostatique

Dans le cadre Nº1 se vérifié l’effet accumulative de l’action anti tumeur de Green Sap par successives incrémentes ascendantes dans l’effet inhibitoire sur la prolifération des cellules tumorales BW (mesuré comme% Inhibition de la prolifération cellulaire).

Ces inhibitions ont fut constatées comparé le % d’inhibition résultante de l’ application de Green Sap sur les cultures des cellules tumorales BW, contre les % de Prolifération détectés en modèle des cellules en absence d’aucun extrait (basales), pour les périodes de temps et les concentrations décrit dans la table.

Comme interprétation des concepts dessus expliqués est le même á dire que pour la dilution 1/400 (dose thérapeutique) aux 96 heures on a trouvé une prolifération des cellules tumorales BW traitées avec Green Sap un 29.6 % inférieur que les mêmes cellules tumorales que n’ont pas fut traitées avec le médicament.

Temps (heures)

Prolifération (% INHIBTION)

 

1:50

1:200

1:400

24

55.0

37.0

24.9

48

74.0

35.5

22.3

72

92.0

26.4

25.0

96

92.5

30.7

29.6

Cadre Nº1 : Effet Inhibitoire de Green Sap  sur lignes de cellules tumorales BW .

En cet essai reste de nouveau démontre la tendance á la accentuation de l’effet antiproliférative provoqué par Green Sap dans les cultures de lignes cellulaires tumorales BW. Cette tendance accumulative de l’effet anti tumeur infère l’importance de maintenir une continuité dans l’application du traitement pour capitaliser cette propriété.

En postérieures essais par la tintions avec teinture excluent “Bleue Tripán” se traitera de démontrer un éventuel effet CYTOTÓXIQUE résultant de l’ application de Green Sap dans les cultures des cellules tumorales BW, au moyen des études de viabilité cellulaire.

 

Effet Cytotoxique

Au moyen de l’étude de viabilité des cellules tumorales BW avec la technique de teintureavec “Bleue Tripán” s’a démontré un important effet cytotoxique résultant de l’application de Green Sap dans les cultures des cellules tumorales BW comme surgit de l’interprétation des dates dans le cadre 1.

Les % de Viabilité á chaque temps se calculent tenant en compte la quantité des cellules vives (que n’incluent pas le colorant d’exclusion Bleue Tripán) en relation avec le totale des cellules (Vives + mortes). Les cellules mortes sont lesquelles incorporent le colorant et par conséquent sont vu de couleur bleu á l’observation microscopique.

TEMPS (heures)

% VIABILITE

1:50

1:200

1:400

24

79

70

89

48

58

69

78

72

27

58

78

96

21

33

49

Cadre 1: % de Viabilité Cellulaire Déterminé  par la technique de teinture avec Bleue Tripán.

Une fois déterminé l’effet CYTOSTÁTIQUE au moyen de l’ application de Green Sap (constaté par la consistent inhibition de la prolifération cellulaire en cultures de cellules tumorales BW), s’aprocédé á déterminer par le % de Viabilité cellulaire l’effet CYTOTOXIQUE résultant de l’ application de Green Sap dans les cultures des lignes de cellules tumorales BW.

Par le mentionné essai on a constaté certainement á périodes de temps croissants une diminution de la viabilité cellulaire ou le même qui est une diminution de les cellules tumorales vives.

Pourtant on peut conclure que Green Sap ne seulement inhibe l’accroissement cellulairetumoral que aussi tue les cellules tumorales, propriétés que lui converti en un très intéressante médicament anti tumeur.

Etude de l’Effet Synergique des Herbes

On a réalisé un travail scientifique pour démontrer l’effet synergique de 3 herbes que composent le produit. Pour ça s’a déterminé le pourcentage d’inhibition de la prolifération cellulaire de la teinture et de chaque teinture d’extrait de chaque herbe par séparé, en différentes dilutions. Dans le cadre a continuation se montrent les résultats obtenus comme pourcentage d’inhibition d’accroissement des lignes cellulaires BW 5147 a différentes dilutions de la teinture (mélange des 3 herbes).

Dilution

BW5147

I.E.

% Inhib

1/25

0.03

97.4

1/50

0.045

95.3

1/100

0.11

88.7

1/250

0.26

74.0

1/500

0.48

51.7

1/1000

0.70

29.6

1/2000

0.88

12.4

1/4000

0.87

13.0

TABLE I: Pourcentage d’inhibition d’accroissement des lignes cellulaires BW 5147 á différentes dilutions de la teinture madre.

TEINTURES DES EXTRAITS INDIVIDUELS:

A continuation se présente la Table II: “ Effet inhibitoire des teintures des 3 herbes par séparé”.

 

Dilution

PLANTAGO (P)

CARQUEJA (C)

ROMERO (R)

I.E.

% Inhib

I.E.

% Inhib

I.E.

% Inhib

1/25

0.75

24.9

0.50

49.7

0.12

88

1/50

0.73

26.8

0.58

42

0.21

78.5

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